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文献速递诊断脑膜炎和脑炎的宏基因组测
文章标题：ClinicalMetagenomicSequencingforDiagnosisofMeningitisandEncephalitis
研究人员：M.R.Wilson,H.A.Sample,K.C.Zorn,S.Arevalo,G.Yu,J.Neuhaus,S.Federman,D.Stryke,B.Briggs,C.Langelier,A.Berger,V.Douglas,S.A.Josephson,F.C.Chow,B.D.Fulton,J.L.DeRisi,J.M.Gelfand,S.N.Naccache,J.Bender,J.DienBard,J.Murkey,M.Carlson,P.M.Vespa,T.Vijayan,P.R.Allyn,S.Campeau,R.M.Humphries,J.D.Klausner,C.D.Ganzon,F.Memar,N.A.Ocampo,L.L.Zimmermann,S.H.Cohen,C.R.Polage,R.L.DeBiasi,B.Haller,R.Dallas,G.Maron,R.Hayden,K.Messacar,S.R.Dominguez,S.Miller,andC.Y.Chiu
研究单位：UniversityofCalifornia,SanFrancisco
发表时间：
期刊名称：NEJM
影响因子：70.67
分区：一区
核心亮点：
1.a1-year,multicenter,prospectivestudy.
2.Thisdiagnosticapproachmayguideearlierandmoretargetedtreatmentsforneuroinvasiveinfections.
3.MetagenomicNGSofCSFobtainedfrompatientswithmeningitisorencephalitisimproveddiagnosisofneurologicinfectionsandprovidedactionableinformationinsomecases.
1.一项为期1年的多中心前瞻性研究。
2.这种诊断方法可能指导更早和更有针对性的治疗神经侵袭性感染。
3.脑膜炎或脑炎患者获得的脑脊液元基因组NGS改善了神经感染的诊断，并在某些情况下提供了可操作的信息。
思路与方法：
1.筛选入组患者。
2.收集CSF样本，宏基因组测序，确定病原体。
3.医生与临床微生物测序委员会讨论后续方案，对宏基因组对临床作用进行反馈。
摘要
BACKGROUND
Metagenomicnext-generationsequencing(NGS)ofcerebrospinalfluid(CSF)hasthepotentialtoidentifyabroadrangeofpathogensinasingletest.
METHODS
Ina1-year,multicenter,prospectivestudy,weinvestigatedtheusefulnessofmetagenomicNGSofCSFforthediagnosisofinfectiousmeningitisandencephalitisinhospitalizedpatients.AllpositivetestsforpathogensonmetagenomicNGSwereconfirmedbyorthogonallaboratorytesting.Physicianfeedbackwaselicitedbyteleconferenceswithaclinicalmicrobialsequencingboardandbysurveys.Clinicaleffectwasevaluatedbyretrospectivechartreview.
RESULTS
Weenrolledpediatricandadultpatientsateighthospitals.Patientswereseverelyill:48.5%hadbeenadmittedtotheintensivecareunit,andthe30-daymortalityamongallstudypatientswas11.3%.Atotalof58infectionsofthenervoussystemwerediagnosedin57patients(27.9%).Amongthese58infections,metagenomicNGSidentified13(22%)thatwerenotidentifiedbyclinicaltestingatthesourcehospital.Amongtheremaining45infections(78%),metagenomicNGSmadeconcurrentdiagnosesin19.Ofthe26infectionsnotidentifiedbymetagenomicNGS,11werediagnosedbyserologictestingonly,7werediagnosedfromtissuesamplesotherthanCSF,and8werenegativeonmetagenomicNGSowingtolowtitersofpathogensinCSF.Atotalof8of13diagnosesmadesolelybymetagenomicNGShadalikelyclinicaleffect,with7of13guidingtreatment.
CONCLUSIONS
Routinemicrobiologictestingisofteninsufficienttodetectallneuroinvasivepathogens.Inthisstudy,metagenomicNGSofCSFobtainedfrompatientswithmeningitisorencephalitisimproveddiagnosisofneurologicinfectionsandprovidedactionableinformationinsomecases.
背景：脑脊液(CSF)的元基因组下一代测序(NGS)有可能在一次试验中识别广泛的病原体。
方法：在一项为期1年的多中心前瞻性研究中，我们研究了脑脊液mNGS在住院患者感染性脑膜炎和脑炎诊断中的作用。所有对mNGS病原体的阳性试验均经正交实验室试验证实。医生的反馈是通过与临床微生物测序委员会的电话会议和调查得到的。回顾性图表评价临床疗效。
结果：医院招收了名儿科和成人患者。患者严重疾病：48.5%被送进重症监护病房，所有研究患者的30天死亡率为11.3%。共诊断57例神经系统感染58例（27.9%）。在这58例感染中，mNGS鉴定了13例（22%），医院临床检测。在其余45例感染中（78%），mNGS在19例中同时诊断。在未经元组NGS鉴定的26例感染中，11例仅经血清学检测诊断，7例来自脑脊液以外的组织样本，8例因脑脊液中病原体滴度低而对元组NGS阴性。在13个诊断中，总共有8个完全由mNGS进行的诊断具有可能的临床效果，13个指导治疗中有7个。
总结：常规的微生物测试往往不足以检测所有的神经侵袭性病原体。在本研究中，从脑膜炎或脑炎患者获得的脑脊液mNGS改善了神经感染的诊断，并在某些情况下提供了可操作的信息。
图表
图1.研究概述。
A显示了通过研究的患者流程。
B显示8个参与站点。圆圈的大小与在给定地点登记的病人人数成正比。
C显示了元基因组下一代测序(NGS)检测的协议。在临床实验室接收脑脊液(CSF)样品后，分离核酸(DNA和RNA)，然后构建元基因组NGS文库并进行测序。利用自动计算管道(基于序列的超快病原体鉴定[SURPI+])对mNGS数据进行分析，并在实验室主任审查后在电子病历(EMR)中报告结果。CHCO代医院；CHLA医院；CNMC儿童国家医疗中心；SJCRH医院；UCD加州大学戴维斯分校；UCLA加州大学洛杉矶分校；UCSF加州大学旧金山分校；ZSFGH医院。
表1.例患者的人口学和临床特征。
图2.mNGS检测结果及临床效果。
A显示了在研究患者中已建立的诊断的比例和类别。对例患者中的例（50.5%）进行了CSF常规临床检查和元组NGS检测。共有58例感染（粉红色圆圈)，57例病人(27.9%）。常规检测包括培养、聚合酶链反应(PCR)、血清学（抗体）和脑脊液及其他体液或组织的抗原检测。在“其他”类别中的诊断包括解决治疗感染、特发性颅内高压、后逆性脑病综合征、神经外科（化学）脑膜炎和噬血细胞淋巴组织增生症。
B显示了在脑脊液细胞计数的指定间隔内具有高DNA或RNA背景的患者的数量和百分比。高背景样品(定义为对应于内部尖峰DNA或RNA控制的归一化读取计数不符合预先设定的阈值的样品)的比例随着细胞计数的增加而增加。
C显示在临床微生物测序委员会(CMSB)会议期间讨论的补充mNGS分析。
D显示临床医生对单纯由mNGS诊断的病例的反馈。
E显示仅由mNGS诊断的病例的临床效果。描述了mNGS结果对抗生素或抗病毒治疗的起始、停止或长度的具体影响。EBV表示EB病毒、HEV乙型肝炎病毒、HIV-1人类免疫缺陷病毒1型、静脉注射和SLEV圣路易斯脑炎病毒。
表2.通过mNGS诊断的感染。
图3.补充mNGS分析。
对mNGS数据进行了补充分析，并在与临床微生物测序委员会的每周电话会议上讨论了结果。星号表示与病人的CSF样本相对应的交互式SURPI+热图上的列，弹出窗口突出显示与给定物种命中对应的单元格。对于面板a和b，绿色跟踪对应于给定核苷酸位置(Y轴，左)的覆盖范围，紫色追踪对应于生物技术信息中心(NCBI)核苷酸(NT)数据库中由mNGS的SURPI+自动映射到最紧密匹配的病毒参考基因组后的成对标识(y轴，右)。
A显示抗病毒药物耐药性的预测。从患者CSF样本中的HIV-1读数读取到参考数据库中最紧密匹配的基因组，表明可以组装完整的病毒基因组（中间)，从而能够预测抗病毒耐药性(右）。使用基于Web的geno2pheno软件获得预测的z分数。对应于普通处方抗逆转录病毒药物（黑色）的z评分相对于易感（绿色)、中间(黄色)或耐药(橙色）表型的参考z评分范围显示。3TC代表拉米夫定、ABC阿巴卡韦、ATZ/r利托那韦-增强阿扎那韦、DRV/r利托那韦-增强达芦那韦、EFV依法韦仑、LPV/r利托那韦-增强洛匹那韦、NNRTI非核苷逆转录酶抑制剂、NRTI核苷逆转录酶抑制剂、NVP奈韦拉平、PI蛋白酶抑制剂、TDF替诺福韦和ZDV齐多呋定。
B显示病毒基因分型。肠道病毒B阳性病例中的病毒基因组是由mNGS读取组装而成的，特异性病毒株经SURPI+鉴定为柯萨奇病毒B5（右）。
C显示病毒感染的纵向跟踪。最初在腹泻儿童粪便中发现的MW多瘤病毒，是在一个免疫功能低下的儿童身上检测到的，表现为急性脑膜脑炎。这一发现被认为具有不明确的临床意义，尽管没有发现其他传染性原因。在记录的水痘-带状疱疹病毒(VZV)葡萄膜炎的第二次住院期间，在3个月后获得的两个CSF样本中检测到MW多瘤病毒读数为0和12。
D显示准确的物种识别。来自mNGS的全长16SrRNA基因的组装使系统发育分析和物种分配成为链球菌炎。通过将25株具有代表性的肺炎链球菌和25株具有代表性的肺炎链球菌菌株（以化脓性链球菌为外群）与患者的16SrRNA序列进行比对，在默认设置下使用MAFFT，然后使用PhyML构建树。
E显示抗生素耐药基因的分析。这些基因是通过对产气肠杆菌（现在改名为产气克雷伯菌）mNGS读取到综合抗生素耐药数据库来鉴定的。
F显示病原体读取的检测低于报告阈值，对应于两种病原体(牛分枝杆菌和星形病毒MLB2)的mNGS热图不符合阳性，因为读数和分布不符合预先设定的阈值。
在E和F中，AmpC表示C类β内酰胺酶，WGS表示NCBI全基因组猎枪数据库。
评论
不足：
从收集样本到得出结果的平均周期为90个小时，而在14年该课题组发表的一篇关于宏基因组临床诊断个案中的整个周期时间仅为48个小时。本文未对时间上的巨大差距做出相应解释。
启发：
本文正文部分逻辑清晰，让读者可以很清晰的理解到本文重点结论及讨论的点。在图表分布上排列清晰。正文内容对图表的阐述相对较少，更多的放到了补充附录里。看起来图文关系不大，其实整个文章是对图表结论性的概括。这篇文章提示我们在写文章的时候应更多的注意逻辑，突出文章重点结论。
参考文献：
M.R.Wilson,H.A.etal.ClinicalMetagenomicSequencingforDiagnosisofMeningitisandEncephalitis.TheNewEnglandJournalofMedicine.[J].13June.8
采编：赵娇娇审核：谢茜荣
