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神经胶质瘤的免疫检查点治疗的现状与希望
作为颅脑肿瘤中恶性程度最高的一类，神经胶质瘤常常导致荷瘤患者仅有很短的生存期。在之前的多篇文献解读中，我们团队对免疫检测点靶向治疗已经做了较为广泛的解析，但是针对神经胶质瘤相关的免疫治疗相关的解读，这是首次。由于胶质瘤的“冷表型”和诱导耐药性等多种因素，导致免疫治疗疗效欠佳，因此免疫检测点靶向治疗在临床上应用仍较为罕见。本篇文章研究旨在全面了解肿瘤微环境和大脑独特的免疫状态对于胶质瘤免疫治疗的潜在影响，以寻求更为敏感的生物标志物来监测潜在的免疫反应，并结合多种免疫治疗联合策略，为开发有效和安全的治疗方法提出思考。那么，就让我们跟随作者的理解探索免疫检测点治疗对神经胶质瘤的治疗价值。
引言在临床上，神经胶质瘤是中枢神经系统最常见和最致命的原发性脑肿瘤，患有该类肿瘤的患者5年生存率低于10%。其中，多形性胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)约占胶质瘤总病例的50%，甚至该类肿瘤患者的5年生存率低于5%，符合世界卫生组织(WHO)IV级肿瘤的诊断标准。糟糕的是，作为目前GBM治疗的金标准，全切除加辅助放化疗仅仅只是姑息性的选择，确诊GBM的患者中位生存期不到15个月。人们渴望在GBM的治疗上获得突破。检查点抑制剂最近在多个实体肿瘤中取得了显著的临床成功，那神经胶质瘤可以不可以复制免疫靶向治疗的成功？然而，由于血脑屏障(BBB)抑制大脑和免疫系统之间的直接接触，中枢神经系统通常被认为是“免疫豁免”部位，免疫治疗尤其是单克隆抗体的系统治疗，能否有效仍未可知。考虑到大脑的独特可及性和组织组成，设计有效的免疫治疗策略并非易事。在此，文章作者努力汇总对大脑独特的免疫学和肿瘤微环境的认识，试图总结各种免疫检查点阻断策略，以及免疫治疗的耐药机制，从而为神经胶质瘤的免疫治疗的开发提供指导性意见。
独特而非豁免的颅脑免疫学在过去的几十年里，大脑“免疫豁免(immunologicallyprivileged)”的概念深入人心。但这一观点最近被众多研究结果推翻。一系列研究表明，白细胞淋巴管存在于硬脑膜窦中，并将抗原从硬脑膜转运到颈部淋巴结。这些发现提出了脑脊液通过胶质淋巴途径介导中枢神经系统和循环之间的免疫通讯这一机制。鉴于大脑和外周免疫系统之间存在传入神经系统，许多人认为中枢神经系统在免疫学上是“独特的”，而非“特权的”。很大程度上，血脑屏障导致了大脑的这种“独特的免疫学”。结构上，血脑屏障由血管内皮细胞和神经胶质细胞之间的生物膜组成。功能上，血脑屏障是循环和大脑之间的动态网络，它阻止大的亲水分子或生物的扩散，同时允许小的疏水分子流入。除了少数如脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌能够通过特定机制进入脑循环，绝大多数血液传播的病原体被排除在脑之外。鉴于中枢神经系统很少接触病原体，大脑组织对炎症的耐受性差，大脑被认为只表现出有限的免疫力。大脑的另一个独特的免疫学特征是它的常驻免疫细胞群。小胶质细胞(MG)是主要的常驻免疫细胞，而大多数其他免疫细胞亚型不存在于中枢神经系统中。然而，最近的研究表明，全身免疫系统完全参与了对中枢神经系统抗原的细胞毒性反应。炎症刺激后，特异性抗原被微球蛋白识别，并通过胶质淋巴途径呈递到活化的淋巴细胞中，此后大量免疫细胞可以容易地穿透血脑屏障，诱导强烈的炎症和随后的免疫反应。尽管如此，由于不受限制的炎症介导的颅内高压会产生严重后果，先天炎症和适应性免疫反应都必须受到严格调节。
胶质瘤的免疫微环境独特的脑免疫学造就了胶质瘤独特的肿瘤微环境。胶质瘤微环境中存在多种外周免疫成分，包括髓源性抑制细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、中性粒细胞、CD4^+^辅助T细胞(Th)、CD8^+^细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和调节性T细胞(Treg)，而与其他肿瘤相比，它们在胶质瘤中的浸润率明显较低。
此外，各种肿瘤衍生的细胞因子和趋化因子对浸润性免疫细胞的构建会重新编程，导致它们获得独特的功能表型并转化为肿瘤相关免疫细胞。因此，这些肿瘤相关免疫细胞可通过诱导炎症或抗炎反应，影响神经胶质瘤的进展、复发和抗药性。如Figure1所示，多样化的细胞亚群之间相互交流，以协同、拮抗等效应不断调节神经胶质瘤细胞在大脑的定植和侵袭。
作为大多数实体肿瘤肿瘤微环境中免疫反应的最重要组成部分，由CD4+Th、CD8+CTLs和CD4+/CD25+/Foxp3+Treg代表的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)在中枢神经系统中的数量与其他肿瘤类型相比非常少。CD4+Th和CD8+CTL亚群随着肿瘤恶性程度的增加而增加，从世卫组织二级肿瘤的39%开始，在三级肿瘤中上升到73%，四级肿瘤中上升到98%。同时，CD8+CTL计数的增加和患者预后的改善之间的相关性先前已有报道。胶质瘤细胞中的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)阻止T细胞的激活，并通过与PD-1结合诱导T细胞凋亡。此外Treg细胞也在免疫抑制微环境中发挥着重要作用。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是胶质瘤微环境中主要的浸润性免疫成分。几项研究报告称，大多数TAMs来源于循环单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)，而其余比例来源于小胶质细胞。未成熟的单核细胞迁移到肿瘤微环境，并在暴露于几种细胞因子后发育成TAMs。
在胶质瘤微环境中，肿瘤或效应T细胞衍生的细胞因子促进巨噬细胞效应机制在具有抗肿瘤反应的促炎“M1”表型和具有抗炎反应的免疫抑制“M2”表型之间的变化。在神经胶质瘤的早期阶段，TAMs通过促炎的“M1”表型抑制肿瘤增殖，而在晚期神经胶质瘤中，TAMs的主要特征是“M2”表型，其通常诱导免疫抑制反应和肿瘤的免疫逃逸。小胶质细胞也表现出与单核细胞来源的巨噬细胞相似的可塑性。鉴于TAMs的功能多样性，越来越多的研究投到了这个领域。
骨髓源性抑制细胞肿瘤微环境中的慢性炎症是由促炎细胞因子的过度表达诱导的，包括CSF-1、VEGF、TGF-β和肿瘤坏死因子-α。这些促炎细胞因子通过诱导未成熟髓样细胞转化为骨髓源性抑制细胞(MDSCs)，促进肿瘤生长发展而抵抗对免疫疗法。MDSCs招募外周淋巴器官和骨髓肿瘤微环境，通过各种机制促进肿瘤细胞增殖,包括抑制NK细胞活性，抑制T细胞反应，诱导T细胞凋亡、Treg细胞增殖，以及免疫抑制细胞因子的分泌。因此MDSCs导致了免疫治疗的耐药性。将靶向MDSCs的治疗与其他免疫治疗相结合已成为一种很有前景的治疗策略。在胶质瘤中，相关研究集中于抑制招募或从髓系前体形成MDSCs的策略。由于越来越多的证据表明MDSCs的功能依赖于肿瘤的类型。因此应当对MDSCs进行转录组特征分析，以确定分化为MDSCs的抑制功能和机制，这有助于明确针对MDSCs在治疗胶质瘤中的临床价值。
肿瘤相关中性粒细胞与在感染期间的促炎功能完全相反，中性粒细胞有利于肿瘤的进展和转移。中性粒细胞和肿瘤细胞之间的关系可以解释乳腺癌中循环肿瘤细胞经常逃避免疫监视的现象。免疫抑制肿瘤相关中性粒细胞(TANs)或MDSCs在三阴性乳腺癌中富集，并与获得性免疫检查点阻断抗性相关。在胶质瘤微环境中，TANs通过介导血管生成促进肿瘤恶化。在临床前GBM小鼠模型中证明使用Ly6G+单克隆抗体的TAN去除策略能延长生存期。然而，肿瘤微环境中肿瘤坏死因子募集的潜在机制和肿瘤坏死因子在肿瘤进展中的作用尚未被全面理解，胶质瘤微环境异质性如何影响中性粒细胞重编程仍有待阐明。
自然杀伤细胞自然杀伤细胞(NK细胞)是一种最有效的先天细胞毒性淋巴细胞，在肿瘤的发展过程中，已发现多种抑制NK细胞活性的机制。胶质瘤细胞通过表达与NK细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)相互作用的MHCI类分子(MHCI)，可以抑制抗原呈递细胞(APC)介导的识别和NK细胞介导的杀伤。此外，由于TANs、MDSCs和Treg细胞的联合负调控作用，在胶质瘤微环境中浸润的NK细胞通常是无功能的。
免疫检查点封锁策略和相关抑制剂作者在Table1中统计了目前多个免疫检测点靶点免疫治疗脑胶质瘤相关的临床试验基本信息，我们可以从中发现越来越多的免疫检测点抑制剂被尝试单用，或者作为联合应用中的一部分发挥抗肿瘤效应。
PD-1/PD-L1目前为止，两种抗PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)和三种抗PD-L1抗体(Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab)已投入临床应用，取得了显著疗效。研究发现，抗PD-1单药治疗可增加CD8+CTL与Treg细胞的比例，并与放疗和其他检查点抑制剂联合使用时增强疗效。Schalper等人报道了30例GBM患者使用维鲁单抗治疗，导致趋化因子转录增加，TILs浸润，肿瘤微环境中TCR的多样性。CheckMate?III期临床试验发现，在复发性GBM的治疗中，对比尼鲁单抗和贝伐单抗(抗vegfa)无OS获益。在CheckMate试验中，接受尼鲁单抗加放疗的未甲基化O6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶(MGMT)启动子的新诊断GBM患者与接受放疗加替莫唑胺(TMZ)的治疗相比，本疗法无OS获益。最近，CheckMate-研究报告了类似结果。在这里，新近诊断的带有甲基化MGMT启动子的GBM患者在接受抗PD-1治疗后没有显示PFS获益，对OS的影响仍然悬而未决。显然，这些结果并不符合人们理想的预期。
CTLA-4在活化T细胞或Treg细胞上表达的细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)通过结合APCs上表达的配体CD80和CD86抑制T细胞共刺激信号通路。与PD-1不同，CTLA-4信号发生在T细胞活化的早期阶段，主要表达于淋巴结的T细胞上。在临床前实验中，抗CTLA-4单药治疗延长了GL同基因小鼠模型的OS。虽然CTLA-4阻断策略提高了中位生存期，治愈率为25%，但单药治疗的疗效仍然有限，联合应用抗pd-1治疗或放疗可以显著提高疗效。Reardon等也报道抗CTLA-4和抗PD-1联合治疗可使治愈率提高到75%。为了进一步的研究CTLA-4阻滞作为单药治疗或联合抗PD-1治疗，目前正在对复发性GBM患者进行III期临床试验。
B7族近年来，对B7家族免疫检查点分子的研究增加。除PD-L1(B7-H1)，研究还包括B7-H3(CD)、B7-H4、B7-H5(Vista)、B7-H6和B7-H7(HHLA2)等。B7-H3和B7-H7具有双向影响，既可以共同刺激，也可以共同抑制。通过与特定的配体相互作用，这些分子可以在肿瘤进展中发挥不同作用。例如，最近的研究指出B7-H3与toll样受体信号通路和胶质瘤患者生存不良呈正相关，也有报道B7-H3协同刺激免疫功能并参与抗肿瘤功能。同样，B7-H7在各种实体肿瘤中也表现出相同的现象。抑制NK介导的B7-H6的识别是肿瘤免疫逃逸的重要机制。NK细胞直接通过细胞毒性或通过细胞因子分泌来清除表达B7-H6的肿瘤细胞。B7-H4和B7-H5对免疫系统均有共同抑制功能。但B7家族成员在胶质瘤中的作用和机制仍然很大程度上未知。
IDO，LAG-3和TIM-3吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是通过肾素途径进行左旋色氨酸代谢的关键酶。虽然IDO在肿瘤细胞和树突状细胞(DC)上表达并不是典型的检查点分子，但它可以通过调节色氨酸代谢抑制T细胞的激活，而色氨酸代谢在T细胞的功能中具有重要作用。色氨酸的代谢物也会诱导T细胞凋亡。此外，犬尿氨酸和TGF-β的相互作用可以诱导T细胞中FoxP3的表达，从而导致Treg细胞极化。临床前模型显示，使用IDO抑制剂的临床试验没有达到预期。
淋巴细胞活化基因3(LAG-3)有四个细胞外免疫球蛋白超家族样结构域，与MHCII结合，并负责抑制信号的传递。除了MHCII，另一个LAG-3的配体是Gal?3，它参与了CD8+CTL的抑制。肿瘤来源的抗原诱导了LAG-3的过表达，从而导致CD8+CTL的缺失。小鼠异种移植的研究表明PD-1和LAG-3共同靶向TILs可以限制肿瘤的生长，这可能优于单一的抑制机制。鉴于这一发现，最近的试验集中于抗PD-1和抗LAG-3联合疗法，而不是单一疗法。然而，这项研究绝大多数仍处于临床前阶段。
T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域蛋白3(TIM-3)在CD4+和CD8+T细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达。TIM-3通过与配体Gal-9结合，调节T细胞消耗，参与肿瘤免疫抑制和免疫逃逸。临床试验报道TIM-3过表达的GBM患者肿瘤恶性程度较高，生活质量较低，预后较差。这些分子并未如PD-1和CTLA-4那样有影响力，而且绝大多数检查点抑制剂在胶质瘤中的有效性仍值得怀疑。虽然单一检查点抑制是许多肿瘤实体的治疗标准，但在肿瘤进展过程中检查点分子相互协作或拮抗，单一检查点抑制剂很难在系统免疫中发挥决定性作用。因此，监测点抑制剂联合治疗似乎比单一治疗更有效。
临床失败的教训免疫疗法这样有前景的临床前数据也很少转化为胶质瘤的临床成功。胶质瘤治疗的临床转化变复杂的原因有二：
首先，胶质瘤具有“冷肿瘤”表型，这与免疫治疗的不良反应有关。由于CNS的特殊环境，即使抑制检查点分子诱导T细胞对胶质瘤的反应，抗原特异性T细胞仍处于相对较低的水平。
其次，目前的临床前模型对于反映胶质瘤的真实肿瘤异质性的能力有限。一般来说，GBM可分为4种亚型:经典型、前神经型、神经型和间充质型，各亚型间异质性高。这四种亚型的基因表达存在显著差异，提示靶向检查点分子疗法可能只对表达特定基因的部分亚群有效，对其他亚群无效。
固有耐药迄今为止，胶质瘤的异质性仍被认为是其对多种治疗产生耐药性的基础。例如，EGFR变体三是一种截短的EGFR新抗原，在19%新诊断的GBM患者中表达，其中11%表现出高表达水平。虽然近82%的复发肿瘤不表达EGFR变异体三，但绝大多数间充质亚型显示EGFR变异体三过表达。这一特性使得稳定表达特异性抗原以诱导持久的抗肿瘤免疫应答变得困难。此外，尽管辅助放疗化疗可以提高检查点阻断策略的效率，但放化疗具有免疫抑制功能，可诱导其他抵抗机制，从而进一步降低中枢神经系统的免疫反应。
适应性耐药肿瘤可以通过篡夺防止自身免疫的机制来对抗免疫系统的攻击。尽管免疫检查点分子可能在各种肿瘤中以“基线”表达，但在免疫刺激下可以观察到它们的表达水平显著增加。因此免疫检测到阻断可以引发强烈的抗肿瘤反应。尽管PD-1和CTLA-4阻断策略在一些晚期肿瘤中取得了持久的临床反应，但很大一部分患者没有从检查点阻断中获益。对此的一个解释是TIL的严重衰竭。由于其他对检查点抑制剂反应差的肿瘤使用类似的适应性耐药机制，GBM的免疫衰竭程度严重但不罕见。另一种解释是，机制相似的检查点分子可以相互补偿。例如，在抵抗PD-1阻断的肿瘤中观察到替代检查点分子TIM-3的上调。一个免疫检查点的下调通常会上调其他免疫检查点，最终导致持久的免疫抑制和对阻断的抵抗。鉴于这种机制，目前的临床试验侧重于通过靶向替代免疫检查点来克服PD-1和CTLA-4阻断策略的适应性耐药性。
获得性耐药肿瘤的获得性耐药性通常是指由免疫压力引起的遗传变异。获得性耐药对恶性胶质瘤的确切作用仍然未知，因为胶质瘤治疗的低反应性和持久性被认为是一种重要的内在耐药机制。相比之下，最近的研究报告了66例接受PD-1阻断治疗的复发性GBM患者(例)。其中，17名患者根据脑部成像和切除组织的特征被确定为应答者。发现应答者中的肿瘤富含丝裂原活化蛋白激酶途径的改变，并表现出分支进化模式，而无应答的肿瘤在编码PTEN和非克隆进化模式的基因中更常发生突变。值得注意的是，有反应者的操作系统明显长于无反应者(14.3个月对10.1个月)。鉴于上文提到的GBM的异质性，除了内在抗性之外，获得性抗性似乎在抵抗检查点阻断中起重要作用。
胶质母细胞瘤微环境中的缺氧迄今为止，研究主要集中在肿瘤细胞本身，而肿瘤微环境的问题往往被忽视。在此，本文进一步探讨了缺氧在肿瘤免疫微环境中的作用。缺氧可能通过各种机制保护肿瘤免受免疫反应，包括通过抑制自然杀伤细胞和结缔组织细胞活性，促进免疫抑制细胞因子，以及通过增强免疫抑制细胞(Treg细胞，TAMs和中性粒细胞)。
抑制性免疫细胞和细胞因子缺氧被认为在TAM极化中起关键作用。它可以促进“M2”表型，并有助于肿瘤生长、免疫抑制和肿瘤血管生成。在评估肿瘤免疫微环境中细胞极化的生物信息学研究中，具有“M2”表型的Treg细胞、中性粒细胞和TAMs在缺氧条件下显著增加。此外，缺氧还促进TGF-b和白细胞介素-10的表达，这是两种公认的抑制性细胞因子。
未来方向肿瘤异质性和检查点分子的改变和肿瘤微环境中的缺氧中广泛的免疫抑制机制使胶质瘤的治疗复杂化，也解释了临床前数据很少转化为临床成功的原因。鉴于此，个体化治疗和治疗反应的实时监测至关重要。
生物标记用于胶质瘤免疫治疗的合适生物标志物仍然未知。最近，研究报道抗PD-1治疗导致免疫细胞中T细胞和IFN相关基因表达的上调，以及肿瘤细胞中细胞周期相关基因表达的下调。抗PD-1治疗似乎在具有特异性免疫应答的肿瘤中导致不同的反应，包括T细胞克隆扩增的增加、外周T细胞PD-1表达的减少和循环中单核细胞的减少。液体活检有望成为神经胶质瘤生物标志物反应监测的成功策略。例如，基于循环肿瘤DNA检测的肿瘤突变负荷(TMB)显示与抗PD-1反应高度相关。同时，胶质瘤的循环肿瘤细胞(CTCs)为无创监测肿瘤进展提供了独特的优势，这可以进一步识别假进展和放射性坏死。综上所述，一个有效的生物标志物不仅可以帮助选择个体化治疗，而且可以及时反映患者何时产生耐药性以调整治疗。
联合药物疗法胶质瘤的免疫治疗抗性是多种因素的结果：治疗早期的内在抗性和适应性抗性，以及由遗传变异介导的治疗期间的获得性抗性。由于独特的耐药机制，胶质瘤检查点抑制剂的单一疗法似乎不能诱导持久的抗肿瘤反应。因此，联合药物治疗可能显示出优势和更高的疗效。例如，在临床前模型中，抗PD-1联合抗TIM-3协同提高了存活率。此外，免疫检查点阻断和抗肿瘤相关免疫细胞(TAMs，MDSCs)的结合也有望治疗胶质瘤。因此，在精确医学时代，更全面地了解免疫细胞在肿瘤微环境中的作用，以及功能性免疫细胞类型和肿瘤反应的特异性生物标志物，对于胶质瘤患者的个体化治疗可能是必要的。
总结本文作者通过这篇综述向我们充分展示了当前免疫检测点靶向治疗在神经胶质瘤的尝试，也向我们展现了神经胶质瘤的多途径耐药模式以及多项临床前和临床的相关结果。尽管越来越多的不同靶点的免疫检测点抑制剂被开发，但是神经胶质瘤低免疫细胞浸润肿瘤微环境，很难让肿瘤抗原特异性效性T细胞能够得到足够的抗肿瘤功能释放。不管是基于肿瘤引流淋巴结激活的肿瘤特异性杀伤免疫细胞还是循环系统引入的肿瘤特异性杀伤免疫细胞，都很难高效、持续的浸润神经胶质瘤微环境中，这会导致免疫治疗的疗效也许难以显著提升。同时，正如开篇我们提到的，单克隆抗体大分子是很难高效的穿透血脑屏障，这也会进一步限制免疫检测点抑制剂效力。当然，随着越来越多联合治疗模式的兴起，基于肿瘤疫苗、细胞过继性治疗、手术和放疗等多渠道的与免疫检测点抑制剂靶向治疗的联合，也许会在未来限制神经胶质瘤的复发和转移，发挥举足轻重的作用。
参考文献：Qi,YangzhiLiu,BaohuiSun,QianXiong,XiaoxingChen,Qianxue.().ImmuneCheckpointTargetedTherapyinGlioma:StatusandHopes.FrontiersinImmunology.11.10./fimmu...
编辑：包逸雯
校审：吕琼
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